化妝品安全性評價程序和方法
( 國標 GB7919-87 摘要 )
中華人民共和國國家標準 GB7919-87: 化妝品安全性評價程序和方法
Procedures and methods of safety evaluation for cosmetices
1 - 目的
為向廣大消費者提供符合衛生要求的化妝品，防止化妝品對人體產生近期和遠期危害，特製定本程序和方法。
2 - 適用范圍
本程序和方法適用於在我國生產的銷售的一切化妝品原料和化妝品產品。
3 - 化妝品安全性評價程序
3.1 第一階段:急性毒性和動物皮膚、粘膜試驗
3.1.1 急性毒性試驗
3.1.1.1 急性皮膚毒性試驗
3.1.1.2 急性經口毒性試驗
3.1.2 動物皮膚、粘膜試驗
3.1.2.1 皮膚刺激試驗
3.1.2.2 眼刺激試驗
3.1.2.3 皮膚變態反應
3.1.2.4 皮膚光毒和光變態反應試驗
3.2 第二階段:亞慢性毒性和致畸試驗
3.2.1 亞慢性皮膚毒性試驗
3.2.2 亞慢性經口毒性試驗
3.2.3 致畸試驗
3.3 第三階段:致突變、致癌短期生物篩選度試驗
3.3.1 鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗(Ames)試驗
3.3.2 體外哺乳動物細胞染色體畸變和SCE檢測試驗
3.3.3 哺乳動物骨髓細胞染色體畸變率檢測試驗
3.3.4 動物骨髓細胞微核試驗
3.3.5 小鼠精子畸形檢測試驗
3.4 第四階段:慢性毒性和致癌試驗
3.4.1 慢性毒性試驗
3.4.2 致癌試驗
3.5 第五階段:人體激發斑貼試驗和試用試驗
4 - 對化妝品原料和化妝品產品安全性評價規定
4.1 凡屬於化妝品新原料，必須進行五個階段的試驗。
4.2 凡屬於含藥物化妝品必須進行動物急性毒性試驗、皮膚與粘膜試驗和人體試驗，但是根據化妝品所含成分的性質、使用方式和使用部位等因素，可分別選擇其中幾項甚至全部試驗項目。
4.3 凡屬於化妝品新產品必須進行動物急性毒性試驗、皮膚與粘膜試驗和人體試驗，但是根據化妝品所含成分的性質、使用方式和使用部位等因素，可分別選擇其中幾項甚至全部試驗項目。
4.4 凡進口化妝品應由進口單位提供安全性評價資料。
5 - 化妝品安全性評價試驗方法
5.1 急性皮膚毒性試驗
人體接觸化妝品主要途徑是皮膚。當評價化妝品及其成分對人體健康的可能危害時，進行皮膚毒性的研究是必不可少的。
5.1.1 目的：確定受試物能否經皮膚滲透和短期作用所產生的毒性反應，並為確定亞慢性度驗提供實驗依據。
5.1.2 定義：系指受試物塗敷皮膚一次劑量後所產生的不良反應。
劑量表示方法：以敷用受試物的質量(g 、mg)或以實驗動物平均單位體重敷用受試物的質量(mg/kg)來表示。
一次敷用受試物引起50%受試動物死亡的劑量，稱之為半數致死量(LD50)。LD50值的單位為mg或 g/kg體重。
5.1.3 動物的準備：選用兩種性別成年大鼠、豚鼠或家兔均可。建議試驗起始動物體重范圍為大鼠200∼300g，豚鼠350∼450g，家兔2.0∼3.0kg。
實驗動物應在動物籠內觀察3∼5天，使其適應環境，並觀察其健康狀況。
正式給藥前 24小時，將動物背部脊柱兩側毛髮剪掉或剃掉，注意不要擦傷皮膚，因為損傷能改變皮膚的滲透性，受試物塗抹處，不應少於動物體表面積的10%。
5.1.5 劑量和分組：將兩種性別的實驗動物分別隨機分為5∼6組，若用賦形劑，需設賦形劑對照組。
機率單位--對數圖解法，每組最好10只動物。各劑量組間要有適當的組距，以使各劑量組產生一系列的毒性反應或死亡率。最高劑量可達2000mg/kg。
5.1.6 試驗方法：將受試物均勻地塗敷於動物背部，並用油紙和兩層紗布覆蓋，再用無刺激性膠布或繃帶加以固定，以防脫落和動物舔食受試物，共敷藥24小時。試驗結束後，可用溫水或適當的溶劑清除殘留的受試物。一般觀察一周，若給藥4天后仍有動物死亡時，仍需繼續觀察一周。
給藥後注意觀察動物的全身中毒表現和死亡情況，包括動物皮膚、毛髮、眼睛和粘膜的變化，呼吸、循環、自主和中樞神經系統、四肢活動和行為方式等的變化，特別要注意觀察震顫、驚厥、流涎、腹瀉、嗜睡、昏迷等現象。
凡是試驗過程中死亡的動物和/或有毒性反應的動物，均應進行尺檢和肉眼觀察。當肉眼可見病變時，還應進行病理組織學鏡檢。
5.2 急性經口毒性試驗
當化妝品成分的皮膚毒性很低低時，很難測得其經皮LD50，為瞭解該化學物質與已知毒物的相對毒性，以及由於嬰幼兒誤服化妝品的可能，進行經口毒性試驗也很必要。
5.2.1 定義：系指受試物一次經口飼予動物所引起的不良反應。劑量表示法同急性皮膚毒性試驗。
5.2.2 動物的準備：分別選用兩種性別的成年小鼠和/或大鼠。小鼠體重18∼22g，大鼠180∼200g，或選擇其它敏感的動物。
實驗前，一般禁食16小時左右，不限制飲水。
5.2.3 受試物溶液的配製：常用水或食用植物油為溶劑。若受試物不溶於水或油中，可用羧甲基纖維素、明膠、澱粉做成混懸液。給藥最大體積，小鼠不超過0.4ml/20g體重，大鼠不超過1.0m×100/g體重。
5.2.4 劑量和分組：一般分為5∼6個劑量組。每組動物數5∼10只，根據所選LD50計算方法而定。各劑量組間間距大小，隨受試物的毒性作用帶寬窄而異。通常以較大組距和較少量動物進預
試，找出其粗略致死劑量范圍，然後再設計正式試驗的劑量分組。
受試物最高劑量可達5000mg/kg體重。
5.2.5 試驗方法：正式試驗時，將動物稱量，並隨機分組，然後用特製的灌胃針頭將受試物一次給予動物。若估計受試物毒性很低，一次給藥容積太大，可在24小時內分成2∼3次給藥，
但合併作為一日劑量計算。給藥後，密切注意觀察並記錄動物的一般狀態、中毒表現和死亡情況，並進行LD50的計算，其方法見附錄B。
5.3 皮膚刺激試驗
皮膚刺激是指皮膚接觸受試物後產生的可逆性炎性症狀。
5.3.1 試驗方法的原則
5.3.1.1 受試物應以一次劑量或多次劑量涂(敷)於健康的無破損的皮膚上。每種受試物至少
要用4只健康成年動物。
5.3.2 試驗方法
5.3.2.1 急性皮膚刺激試驗(一次皮膚塗抹實驗)
5.3.2.1.1 試驗前24小時，將實驗動物背部脊柱兩側毛剪掉，不可損傷表皮，去毛范圍左、右各約3cm×6cm。
5.3.2.1.2 取受試物0.1ml(g)滴在2.5cm×2.5cm大小的四層紗布上敷貼在一側皮膚上，或直接將受試物涂在皮膚上，然後用一層油紙覆蓋，再用無刺激性膠布和繃帶加以固定。另一側涂賦形劑作為對照。敷用時間一般為24小時，亦可一次敷用4小時。試驗結束後用溫水或無刺激性溶劑除去殘留受試物。
5.3.2.1.3 於除去受試物後1、24和48小時觀察塗抹部位皮膚反應，按表1和表2進行皮膚反應積分和刺激強度評價。
5.3.2.2 多次皮膚刺激試驗
5.3.2.2.1 先將實驗動物背部脊柱兩側皮膚的毛剪掉或剃掉，去毛范圍各為2.5cm×2.5cm。
5.3.2.2.2 取受試物0.1∼0.5ml(g)塗抹在一側皮膚毛，另一側涂賦形劑作為對照，每天塗抹1∼2次，連續塗抹14天每次涂藥前應剪毛，不得損傷皮膚保證受試物與皮膚充分接觸。
5.3.2.2.3 每天觀察皮膚反應，按表1評分。脫悄積分為1。最高刺激指數為14(觀察次數)×8(總積分數)＝112。
5.4 眼刺激試驗
眼刺激性是指眼表面接觸受試物後產生的可逆性炎性變化。
5.4.1 試驗方法的原則
5.4.1.1受試物應以一次劑量或多次劑量滴入(涂入)或噴洒眼內。
5.4.1.2 每種受試動物的眼睛應保證無任何炎性反應和眼損傷。
5.4.1.3 每組試驗動物數至少4只，採用自身對照，首選動物為家兔。
5.4.1.4 受試物使用濃度一般用原液或用適當無刺激性賦形劑配製的50%軟膏或其他劑型。
5.4.1.5 已證明有皮膚刺激性的物質，不必進行本項試驗。
5.4.2 試驗方法
5.4.2.1 一次眼刺激試驗
5.4.2.1.1 將液態或軟膏(0.1ml或100mg)受試物滴入(涂入)實驗動物一側結膜囊內，另一側眼作為對照。滴藥後使眼被動閉合5∼10s，記錄滴藥後6、24、48和72小時眼的局部反應，第4、7天觀察恢復情況。觀察時應用熒光素鈉檢查角膜損害，最好用裂隙燈檢查角膜透明度、虹膜紋理改變。
5.4.2.1.2 如果受試物明顯引起眼刺激反應，可再選用6只動物，將受試物滴入一側結膜囊內，接觸4s或30s後用生理鹽水沖洗乾淨，再觀察眼的刺激反應。
5.4.2.1.3 按表4所列眼損害分級標準積分，再按表5進行眼刺激強度的評價。
5.4.2.2 多次性眼刺激試驗
將受試物原液0.1ml或配製成的50%軟膏約100mg滴入或涂入一側結膜囊內，另一側眼作為對照，每日一次，連續14天。實驗結束後，繼續觀察7∼14天，按表4分級標準記錄眼的刺激反應，並按表5眼刺激性評價標準進行眼刺激強度的評價。
5.4.3 結果評價
按上述分級評價標準評定，如一次或多次接觸受試物，不引起角膜、虹膜和結膜的炎症變化，或雖引起輕度反應，但這種改變是可逆的，則認為該受試物可以安全使用。
在許多情況下，哺乳動物眼的反應較人敏感，從動物試驗結果外推到人可提供較有價值的依據。
5.5 皮膚變態反應試驗
皮膚變態反應是指通過重複接觸某種物質後機體產生免疫傳遞的皮膚反應。化學物質引起的變態性接觸性皮炎，屬Ⅳ型(即延遲型)變態反應，在人類的反應可能是瘙痒、紅斑、丘疹、水?或大?，動物僅見皮膚紅斑和水腫。
5.5.1 試驗方法的原則
5.5.1.1 由於接觸致敏的發病過程致敏(誘導)和激發兩個階段，動物在第一次接觸受試物後至少1周，再次給予激發接觸。通過激發接觸能否引起皮膚反應確有無致敏作用。
5.5.1.2 實驗首選動物為白色豚鼠，每組動物數10∼25只。
5.5.2 豚鼠最大值試驗 ( 皮內和涂皮結合法，簡稱GPMT )
5.5.2.2 從頭部向尾部成對地做三次皮內注射。(1)注射0.1mlFCA﹔(2)注射0.1ml受試物﹔(3)注0.1ml受試物與FCA的等量混合物。如圖1所示，各點間距1.5cm。
5.5.2.3 注射後第8天，用2cm×4cm濾紙涂以用適當賦形劑(花生油、凡士林、羊毛脂等)配製的受試物，將其貼敷在上背部的注射部位，持續封閉固定48小時，作為第二次致敏。為加強致敏作用，對無皮膚刺激作用的化學物質，可在第二次致敏前24小時，在注射部位塗抹10%十二烷基硫酸鈉(SLS)。對照組僅用溶劑或賦形劑注射或塗抹。
5.5.2.4 激發接觸，即在末次致敏後14∼28天，分別用2cm×2cm。的濾紙涂以受試物，再次貼敷在上背部兩側的去毛區，持續封閉和固定24小時。對照動物作同樣處理。
5.5.2.5 激發接觸後，24、28和72小時觀察反應，按表6進行皮膚反應強度評分。
5.5.3 局部封閉涂皮法(Buehler test簡稱BT)
5.5.3.1 實驗前24小時，用脫毛劑將豚鼠背部左側3cm×3cm范圍區脫毛。
5.5.3.2 將受試物0.1∼0.2ml涂在2cm×2cm濾紙上，並將其敷貼在去毛區，二層紗布一層油紙覆蓋，再以無刺激膠布封閉固定，持續6小時。第7天和第14天以同樣方法重複一欠。
5.5.3.3 激發接觸，即末次致敏後14∼28天，將0.1∼0.2ml或低於誘導濃度的受試物斑貼於豚鼠背部左側2cm×2cm去毛區(接觸前24小時脫毛)，然後用二層紗布、一層油紙和無刺激膠布固定6小時，將斑貼受試物拿掉，24和48小時後觀察皮膚反應，按表5評分。
對照動物僅給予激發接觸。
本試驗要求動物數每組10∼20只。
5.6 皮膚光毒和光變態反應試驗
皮膚光變態反應是指某些化學物質在光能參與下所產生的抗原抗體皮膚反應。不通過機體免疫機制，而由光能直接加強化學物質所致的原發皮膚反應，則稱為光毒反應。
5.6.1 試驗方法的原則
5.6.1.1 首選動物為白色豚鼠和白色家鼠，每組動物8∼10只。
5.6.2 皮膚光毒試驗方法
5.6.2.1 先將實驗動物背部脊柱一側的毛剪掉，去毛范圍為3cm×8cm(見圖2)。
5.6.2.2 用中波紫外線燈照射去毛區，時間以秒為單位，分幾檔，測定MED。
5.6.2.3 觀察確定照射後8∼12小時引起一度紅斑(剛剛可見)的照射時間為1個MED。
5.6.2.4 預試驗3天后，用剪刀再將實驗動物背部脊柱兩側去毛共四塊，范圍每塊2cm×2cm。(見圖3)。
5.6.2.5 將受試物0.05∼0.1ml(g)均勻涂在1、2脫毛區，並用黑紙覆蓋避光。
5.6.2.6 涂藥30min後，第一脫毛區用亞MED的中波紫外線燈照射﹔第二脫毛區用黑紙覆蓋不予照射﹔第三區僅用亞MED 的中波紫外線照射，不涂藥﹔第四區作空白對照，不給予任何處理。
5.6.2.7 照射後1、24和48小時，觀察皮膚反應，按表6進行皮膚反應強度的評價。
5.6.2.8 結果評價
凡實驗動物第一次與受試物接觸，並在光能作用下引起類似曬斑的局部皮膚炎症反應，即可認為該受試物具有光毒作用。
5.6.3 皮膚光變態反應試驗
5.6.3.1 誘導階段：實驗動物頸部用脫毛劑脫毛2cm×4cm，於脫毛區四角皮內注射福氏完全佐劑(FCA)各0.1ml(見圖4)。
5.6.3.2 於脫毛區涂20%十二烷基硫酸鈉(SLS)溶液，再將受試物0.1ml(g)涂在該脫毛部位。
5.6.3.3 用波長在280∼400nm的中長波紫外線燈照射涂藥部位，距離和時間以產生明顯紅斑為準。中波紫外線的照射劑量為6.6J/平方cm，長波紫外線為10J/平方cm。
5.6.3.4 隔日重複5.6 3.2 及5.6 3.3 步驟，共5次。
5.6.3.5 激發階段：於誘導操作後兩周，將實驗動物背部脊柱兩側脫毛1.5cm×1.5cm/塊，共4塊(見圖5)。
5.6.3.6 第1塊涂受試物0.1ml後30min用長波紫外線照射﹔第2塊涂受試物後用黑紙遮蓋不照射﹔第3塊不涂受試物，僅用長波紫外線照射﹔第4塊用黑紙遮蓋，不涂受試物，亦不照射。
5.6.3.7 照射後24、48和72小時，觀察皮膚反應，按表5進行皮膚反應強度評分。
5.6.3.8 結果評價
凡化學物質單獨與皮膚接觸無作用，經過激發接觸和特定波長光照射後，局部皮膚出現紅斑、水腫感甚而全身反應，而未照射部位無此反應者，可認為該受試物是光敏、物質。
5.8 亞慢性皮膚毒性試驗
5.8.1 目的：確定受物多次重複塗抹皮膚可能引起健康的潛在危害，為提供經皮滲透可能性，靶器官和慢性皮膚毒性試驗劑量選擇提供依據。
5.8.2 定義：系指受試物重複塗抹動物皮膚所引起的不良反應。
5.8.3 動物的選擇：選用成年大鼠、家兔和豚鼠。建議實驗起始動物體重范圍，大鼠200∼300g，家兔2.0∼3.0kg，豚鼠350∼450g。
5.8.4 劑量和分組：至少有三個劑量組和一個賦形劑對照組。每個劑量組至少20只動物，雌、雄動物各10只。最高劑量組可出現毒性反應，但不能出現死亡。最低劑量組不能出現任何毒性反應。理想的中間劑量，應產生最小的可觀察到的毒性反應。如果受試物塗抹後產生了嚴重的皮膚刺激毒性，應該中止試驗，重新設計試驗方案，使新設計的最高劑量組，由於濃度的降低致使皮膚刺激反應減弱或消失。
5.8.5 試驗方法：將受試物塗抹於動物背部皮膚，涂皮面積參見急性皮膚毒性試驗，對毒性強的物質，塗抹面積可適當減少。實驗期限為90天。
5.8.5.5 病理學檢查：試驗結束時，處死所有動物，進行大體屍檢。
5.9 亞慢性經口毒性試驗
5.9.1 目的：確定受試物重複經口給予動物可能引起健康的潛在危害，為提供靶器官、蓄積可能性和慢性/致癌性實驗提供實驗依據。
5.9.2 定義：系指動物多次重複經口接受化學物質所引起的不良反應。
5.9.3 動物的選擇：一般選用嚙齒類動物，首選品種為大鼠。使用雌雄兩種性別，理想的給藥時間是小於6周令。
5.9.4 劑量和分組：至少應有三個劑量組和一個對照組。每個劑量組至少20只動物，雌雄各10只。各劑量組選擇的原則同亞慢性經皮毒性試驗。
5.9.5 試驗方法：給藥方式可採用受試物摻入飼料、飲水或灌胃方式。當受試物摻入飼料時，在確保給藥量不能影響動物正常的營養需要。以灌胃方式約藥時，每周稱體重，並按體重調整給藥量，以維持穩定的給藥量。
5.9.6 試驗的意義和價值：亞慢性經口毒性試驗將提供重複經口給藥後動物所表現的不良反應的資料。雖然從動物實驗結果外推到人的正確性是有限的，但它能提供無反應劑量和可允許的人類接觸量的有用資料。
5.10 致畸試驗
5.10.1 目的：致畸試驗是鑒定化學物質是否具有致畸性的一種方法。通過致畸試驗，一方面鑒定化學物質有無致畸性，另一方面確定其胚胎毒作用，為化學物質在化妝品中安全使用提供依據。
5.10.2 定義：胚胎發育過程中，接觸了某種有害物質影響器官的分化和發育，導致形態和機能的缺陷，出現胎兒畸形，這種現象稱為致畸作用。引起胎兒畸形的物質稱為致畸原。
5.10.4 實驗動物的選擇：常用的實驗動物是小白鼠，大白鼠和兔，大、小白鼠為首選動物。選用健康性成熟大鼠90∼100天齡，雌性應是初產的。
5.10.5 劑量和分組：至少設4組，其中三組給藥組和一組空白對照組。每組至少12只孕鼠。初次進行致畸試驗或引入新的動物種株時，需要設陽性對照組。常用陽性對照物有敵枯雙、五氯酚鈉、維生素A等等。根據受試物的動物半數致死量(LD50)和蓄積性的大小，確定受試驗的給藥劑量，應該包括無作用劑量組，有致畸作用劑量組和明顯致畸劑量組。
5.10.6 試驗方法
5.10.6.1 “孕鼠”的檢出和給藥時間
雌鼠和雄鼠按1:1(或2:1)同籠，每日晨觀察陰栓(或陰道涂片)，查出陰栓(或精子)的當天定為孕期零天。如果五天內沒查出“受精鼠”，應調換雌鼠。檢出的“受精鼠”按隨機分組，稱重和編號。在大鼠孕期6∼15天期間，每天灌胃給藥。孕鼠於孕期0日、6日、10日、15日和20日稱重，並根據體重調整給藥量。
保持動物室內環境安靜，室溫控制在20度∼25度為宜，適當地給孕鼠增加營養，如加麥芽或蛋糕等。
5.10.6.2 孕鼠處死和一般檢查
第20天孕大鼠用20%硫賁妥鈉1∼1.5ml腹腔注射麻醉斷頭處死。剖腹腔檢查卵巢內黃體數，取出子宮，稱重 ﹔檢查活胎、早期吸收和遲死胎數目。
5.10.6.3 活胎鼠的檢查
逐個記錄活胎鼠體重，性別，體長。外觀檢查頭顱外形、面部、軀乾、四肢等有無畸形，包括：露腦、腦膨出、眼部畸形(小眼、無眼、睜眼等鼻孔擴大，單鼻孔、唇裂、脊柱裂、四肢擴尾畸形等等。
5.11 慢性毒性試驗
5.11.1 目的：確定動物長期接觸化學物質後所產生的危害。
5.11.2 定義：系指動物長期接觸受試物所引起的不良反應。
5.11.3 動物的選擇：一般建議兩種哺乳動物，常用大鼠和小鼠。使用兩種性別。試驗開始時選用剛斷乳的動物。
5.11.4 劑量和分組：一般至少設三至四個劑量組和一個對照組。大鼠至少20只每組每性別，小鼠比大鼠適當增加數量。在慢性毒試驗中，最好要有劑量反應關係。最高劑量組應引起毒性反應或明確的損害作用，低劑量組不應引起毒作用或有害影響。
5.11.5 試驗方法：慢性經口或皮膚毒性試驗，分別採取相應的給藥途徑，具體方法參見相應的亞慢性毒性試驗，試驗期限至少為6個月，甚至一年。
整個試驗期間，對動物的一般觀察、監床檢查和病理學檢查，參見亞慢 性毒 性試驗。除此而外，還有一些具體在求：
(1)在試驗的頭三個月，每周稱重一次﹔在4∼6個月期間，每兩周稱重一次，以後每四周稱重一次。
(2)在試驗開始後的第三月、第六個月和試驗結束時，進行血液學和監床生化學有關指標的測定。一般從每組每種性別中選10只動物進行測定。如果可能的話，最好每次血樣來自相同的動物。
(3)測定臟器的絕對重量和臟體之比，至少包括肝、腎、脾、睪丸和腦等臟器，必要時還應選擇其他臟器。
(4)試驗結束時，對全部的動物，包括試驗過程中死亡的或因處於垂死狀態而被處死的動物都應進行全面的肉眼檢查。
(5)對所有動物(包括中途死亡或處死的)的主要器官和組織(包括皮膚)以及所有肉眼可見的病變、腫瘤或可疑為腫瘤的組織，都應進行病理組織學檢查。
5.11.6 試驗的意義和價值：慢性毒性試驗為提供人長期接觸該化學物質的最大耐受量或安全劑量提供資料。
5.12 致癌試驗
5.12.1 目的：確定經一定途徑長期給予試驗動物不同劑量的受試物的過程中，觀察其大部分生命期間腫瘤疾患產生情況。
5.12.2 定義：系指動物長期接觸化學物質後所引起的腫瘤危害。
5.12.3 動物的選擇：建議對活性不明的化學物質採用兩種動物，一般優先選用小鼠和大鼠，動物的敏感性對試驗影響很大。一般來講，用小鼠誘發肝癌比大鼠容易，相反地，誘發皮下腫瘤則大鼠比小鼠更容易。小鼠和兔子的皮膚對局部塗抹誘發腫瘤可能比大鼠和地鼠更為敏感。
兩種性別都應該使用，常使用剛斷乳或已斷乳動物進行致癌試驗。
5.12.4 劑量和分組：至少三個劑量組和一個對照組。最高劑量組應足以引起最低毒性反應，又沒有因腫瘤以外的因素和明顯改變其正常生命期限。這些毒性反應可能表現為血清?水平的改變，或體重增加受到輕度抑制(降低百分之十)。最低劑量應該不影響動物的正常生長、發育和壽命，即不能引起任何毒性表現。中間劑量應該處於最高最低劑量的中間范圍。
每個劑量組和對照組的每種性別至少25∼50只動物。
試驗期限：應該包括動物正常生命期的大部分時間。建議參考下面幾條準則：
(1) 一般情況，試驗結束時間對小鼠的地鼠應為18個月，大鼠為24個月。
(2) 當最低劑量組或對照組存活的動物數只有百分之二十五時，也可以結束試驗。對於有明顯性別差異的試驗，則其結束的時間，不同的性別應有所不同。若高劑量組因明顯的毒性作用造成過早死亡，此時不應結束試驗。
一個合格的陰性對照試驗應符合下列標準：
(1) 因疾病、被同類吃掉，或因管理問題所造成的動物損失在任何組都不能高於百分之十。
(2) 小鼠和地鼠在18個月，大鼠在24個月時，各組存活的動物不能少於50%。
5.12.5 試驗方法：給受試物的途徑，根據受試物的理化特性和對人有代表性的接觸方式(經
口或皮膚塗抹)而定。
整個致癌過程中，注意觀察並記錄動物出現的症關或死亡情況，尤其要注意腫瘤發生的情況，每一個肉眼可見的或觸及的腫瘤出現的時間、部位、大小、外形發展情況都應記錄。
在試驗的前三個月，每周稱量一次，以後每四周稱量一次。
在實驗過程中死亡或因處於垂死狀態而被處死，以及試驗結束時全部宰殺的動物，都應進行完整的大體屍檢。
5.13 鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗(Ames)試驗
(...)
5.13.3 大鼠肝微粒體?(S-9)的誘導和制備
選健康雄性大白鼠體重200克左右，將多氯聯苯溶於玉米油中，深度為200mg/ml，一次腹腔注射PCB劑量為500mg/kg體重。第五天斷頭處死動物，處死前12小時停食不停飲水。消毒動物皮毛，打開腹腔，取出肝臟後，用0.15mol/LKCL溶液多次沖洗，每克肝臟加0.15mol/LKC13ml後，用前刀剪碎肝臟，並在玻璃勻漿器中制成肝勻漿，然後在低溫高速離心機上，以9000g離心10min，然後分裝保存於液氮或-80°C冰箱中。
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5.15 哺乳動物骨髓細胞染色體畸變檢測試驗
5.15.1 意義：在動物以不同途徑接觸受試化學物後，用細胞遺傳學的方法檢測骨髓細胞染色體畸變率的增加，從而評價受試物的致突變性，進而預測致癌的可能性。
5.15.2 動物選擇：選用成年小鼠或大鼠。
5.15.3 劑量選擇：選用1/2、1/5、1/10、和1/20 LD50劑量為試驗組，另設陽性對照和陰性對照各一組，陽性對照組可用苯，劑量為0.15ml/只，陰性對照為溶劑對照。每組5只動物。
5.15.4 染毒方式：可用經口灌入的方式，共染毒兩次，間隔24小時，於二次給藥後6小時處死動物，於處死前4小時腹腔注射秋水仙素(按劑量4mg/kg).
5.15.5 實驗步驟
5.15.5.1 用頸椎脫臼法處死動物，取出股骨，剃除肌肉等組織。
5.15.5.2 剪去股骨兩端，用注射器吸取5ml生理鹽水，從股骨一端注入，用10ml離心管，從股骨另一端接取流出的骨髓細胞懸液。
5.16 動物骨髓嗜多染細胞微核試驗
研究化學物誘發哺乳動物染色體畸變的方法很多，微核試驗以其簡便，快速，具有一定的敏感性，被廣泛用於遺傳毒理學研究中。
5.16.1 目的
該試驗是一種用體內試驗來檢查骨髓細胞染色體畸變的方法，特別適用於檢出紡錘體的部分損害而出現的染色體丟失或染色單體的無著絲點片段。
5.16.3 實驗動物和劑量分組
小白鼠是微核試驗的常規動物，也可選用大白鼠，一般常用體重為25∼30g的小鼠或體重為150∼200g的大鼠，雌雄皆可，每個劑量組至少5只動物，另外設溶劑對照組和陽性物組。常用環磷?胺做為陽性對照物。
根據受試物理化性質(尤其是水溶性 脂溶性)，確定受試物所用的溶劑，常用水、植物油(玉米油等)或吐溫-80等溶濟。劑量的選擇是很重要的，用藥量太低，會漏掉陽性物，用藥量太大，可致動物死亡，或因對骨髓毒性作用太強，致使嗜多染紅細胞受到抑制，難以獲得正確的結果。一般取受試物LD50的1/2、1/5、1/10、1/20等劑量，以求獲得微核的劑量-反應關係曲線。
5.16.4 給藥途徑和方式
給藥途徑視試驗目的而定，常用經口灌胃方式，建議採用30小時給藥法，即兩次給藥間隔24小時，第二次給藥後6小時取材。
5.16.5 試驗方法
5.16.5.1 骨髓液的制取
動物脫頸處死，打開胸腔，沿著胸骨與肋骨交界處剪斷，剝掉附著胸骨上的肌肉，擦淨血污，橫向切斷胸骨，暴露止髓腔，然後用小骨血鉗擠出胸骨骨髓液。
5.17 小鼠精子畸形檢測試驗
5.17.1 意義：一般認為異常精子數的增加可能是在精子發生中造成遺傳損傷的結果。因此，小鼠精子形態試驗可用於鑒別能引起精子發生功能異常以及引突變的化學物質。
5.17.2 動物：成年雄性小鼠，體重25∼35g。
5.17.3 劑量選擇和動物分組：設1/2、1/5、1/10和1/20 LD50劑量組以及陽性對照和陰性對照組。陽性對照組腹腔注射環磷?胺，劑量為40mg/kg體重。陰性對照組為溶劑對照。
5.17.4 染毒方式：經口灌入受試物，連續5天，每天一次。
5.17.5 實驗步驟
5.17.5.1 於染毒後4周用頸椎脫臼的方式處死動物，剖腹，取出附睪。